Untersuchungen zur L-Isoleucinbildung aus D,L-2-Hydroxybutyrat mit $\textit{Corynebacterium glutamicum}$

Scheer, E.

Book/Report

FZJ-2018-03084

Untersuchungen zur L-Isoleucinbildung aus D,L-2-Hydroxybutyrat mit $\textit{Corynebacterium glutamicum}$

Scheer, E. (Corresponding author)FZJ*

1988
Kernforschungsanlage Jülich, Verlag Jülich

Jülich : Kernforschungsanlage Jülich, Verlag, Berichte der Kernforschungsanlage Jülich 2255, 121 p. (1988)

Please use a persistent id in citations: http://hdl.handle.net/2128/18608

Report No.: Juel-2255

Abstract: 1 . Die Vorstufe D,L-2-Hydroxybutyrat ist kein natürliches Intermediärprodukt der Isoleucinbiosynthese. Die Oxidation zu 2-Ketobutyrat, der natürlichen Vorstufe, wird in $\textit{C. glutamicu}$ durch die NAD-unabhängige D- und L-Lactatdehydrogenase katalysiert. Die D-LDH wird in $\textit{C. glutamicum}$ konstitutiv gebildet, während die L-LDH induzierbar ist. 2. Ausgehend von dem Leucin-auxotrophen Stamm 14310 und dem Wildstamm 13032 wurden Mutanten, die ein verbessertes Wachstum mit D-Lactat als Kohlenstoffquelle zeigten, isoliert. Im Gegensatz zu den Ausgangsstämmen verwerteten zwei Mutanten auch D-HB vollständig. 3. Die Mutante 14310-DL4 hat gegenüber dem Ausgangsstamm 14310 eine 3-4 fach erhöhte D-Lactatdehydrogenase-Aktivität, wobei die Substrataffinität des Enzyms unverändert war. Ebenso unverändert war die spezifische Aktivität für die L-Lactatdehydrogenase. 4. Der Stamm 14310-DL4 bildete in einem Mineralsalzmedium mit 4% Glucose, 0,2 g/1 Leucin und 150 mM Hydroxybutyrat ca. 105 mM (=13,8 g/1) Isoleucin. Dies entsprach einer molaren Ausbeute von 70%. Die Analyse des Kulturfiltrates ergab, daß L-HB unmittelbar nach Beginn des Wachstums von den Zellen aufgenommen wurde, während die Aufnahme des D-Isomers erst nach 24 Stunden begann. 5. Die Mutante 13032-102 nahm die Vorstufe ebenfalls vollständig auf und bildete unter den gleichen Fermentationsbedingungen, jedoch ohne Zusatz von Leucin, nur ca. 38 mM Isoleucin. Es konnte gezeigt werden, daß die Ursache hierfür eine zu geringe spez. Aktivität der Acetohydroxysäuresynthase war. Da im Kulturfiltrat nicht entsprechend erhöhte Mengen von Nebenprodukten der Isoleucinbiosythese nachweisbar waren, deutete dies darauf hin, daß 2-Ketobutyrat auch in andere Stoffwechselwege eingeschleust werden kann. 6. Die Vorstufe Hydroxybutyrat kann über das Lactat-Transportsystem aufgenommen werden, wobei die Affinität bezüglich L-HB deutlich höher ist als zu D-HB. $\textit{C. glutamicum}$ 14310 hat mindestens zwei Lactat-Aufnahmesysteme, wovon eines sowohl D- und L-Lactat transportiert und als auch D,L-HB. Das zweite System ist stereospezifisch und besitzt eine hohe Affinität zu L-Lactat und L-HB. Das spezifischere Aufnahmesystem wird erst nach Wachstum der Zellen auf Lactat exprimiert und die spezifische Aufnahmerate für L-Lactat erhöht sich von 4,5 auf 23,5 nmol/min x mg TG. Die Mutante DL4 ist in ihrem Lactat-Aufnahmesystem gegenüber dem Stamm 1430 verändert. Nach Wachstum auf Glucose nahmen die Zellen kein L-Lactat mehr auf, ebenso war die D-Lactat-Aufname um 75% reduziert. Der Stamm wies jedoch nach Wachstum auf Lactat eine ähnlich hohe spezifische Aufnahmerate für L- und D-Lactat auf wie der Stamm 14310. 7. Die NAD-unabhängigen Lactatdehydrogenasen sind membrangebundene Enzyme, welche sich durch das nichtionische Detergenz N,N-dimethyldodecylamine-N-oxid von der Membran ablösen lassen. Ferner stabilisiert dieses Detergenz die Enzymaktivität. Ein Reinigungsverfahren, in welchem die D-LDH über DEAESepharose, Mono Q und Hydroxylapatit gereinigt wurde, führte zu einer 775 fachen Anreicherung des Enzyms. Dies entspricht einerErhöhung der spezifischen Aktivität von 0,4 auf 310 U/mg. Nach SDS-Gelelektrophorese ergab sich ein Molekulargewicht von 70.000 Da, während die Bestimmung der nativen Molekülgröße mittels Gelfiltration 115.000 $\pm$ 5000 Da ergab. Das Coenzym der D-LDH ist nichtkovalent gebundenes FAD. 8. Kinetische Untersuchungen im Rohextrakt des Stammes 14310-DL4 ergaben für die Oxidation von L-HB einen Km-Wert von 1.9 mM, während er für D-HB 7.1 mM betrug. Die spezifische Aktivität fürdas L-Isomer betrug 0.07 U/mg und für das D-Isomer 0.03 U/mg. So wurde trotz der erhöhten D-LDH-Aktivität der Mutante DL4 D-HB schlechter umgesetzt. Dies weist darauf hin, daß die schlechtere Verwertung von D-HB eine Folge der geringeren Affinität und geringeren spezifischen Aktivität der D-LDH für dieses Substrat ist.

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